新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）能够水解包含青霉素和碳青霉烯在内的几乎所有的β-内酰胺类抗生素。近年来，由于抗生素的滥用导致表达NDM-1基因的多药耐药革兰氏阴性菌在全球范围内传播，给人类健康带来极大的威胁。2014年，一种来源于杂色曲霉（Aspergillus versicolor）的天然产物——Aspergillomarasmine A (简称：AMA)——被证明能够抑制NDM-1的活性，从而恢复表达NDM-1的耐药菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性，因此AMA可以作为潜在的β-内酰胺类抗生素的佐剂，可以克服目前一些革兰氏阴性菌的耐药性，也一定程度上可以缓解开发新型抗生素的压力 （Nature 2014, 510, 503-506）。AMA非常重要和有开发前景的生物活性以及新颖的化学结构吸引了化学家们的注意，2016年，北京大学雷晓光课题组利用“后期氧化”策略首次报道了AMA的全合成，并且通过化学合成修正了该天然产物之前定错的化学结构（Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 4291-4295）。加拿大McMaster大学Gerard D. Wright课题组也利用“两步连续的氮杂环丙烷开环”策略完成了AMA的全合成（Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2210-2212）。在此基础上，Gerard D. Wright课题组又采用磺胺策略以5步、19%的总产率完成了AMA的第二代全合成，并得到了一系列类似物（Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 13259-13262）。2017年，雷晓光课题组利用Mitsunobu反应以6步、28%的总产率实现了更高效的AMA的合成路线（J. Org. Chem. 2017, 82, 13643-13648）。除了化学全合成，2017年，Gerrit J. Poelarends课题组利用化学合成和EDDS酶催化结合的方法以4步、10%的总产率得到AMA (Nat. Catal. 2018, 1, 186-191)。然而已有的5条路线都需要比较繁琐的化学合成步骤以及苛刻的反应条件，且最高产率也不到30%,很难在短时间内得到足量的AMA来满足未来可能的临床治疗需求。因此，探索迄今未知的AMA生物合成途径有可能为今后大规模发酵生产该天然产物或其类似物提供新的思路。
近日，北京大学雷晓光课题组在《ACS Catalysis》期刊上发表文章，首次解析了AMA在米曲霉体内的完整生物合成途径，揭示了AMA是以乙酰丝氨酸（OAS）/磷酸丝氨酸（OPS）和L-天冬氨酸为底物，在AMA合成酶（AMA synthase）的催化下连续构造出两个C-N键而生成。在此基础上该课题组又进一步探究了AMA合成酶及其突变体在生物催化领域的应用前景。该工作为AMA及其类似物的大量制备以及新型抗生物素佐剂的开发提供了新的思路。
图1. 已被报道的AMA的合成路线以及本文的生物合成研究发现
1991年，14C同位素标记实验证明toxinA是AMA的前体（J. Biol. Chem. 1991, 266, 13329-13335）。本文中作者首先探究了AMA和toxin A分子内C-N键是如何构造的。通过文献调研，研究人员发现一个已被报道的PLP依赖的酶——SbnA——能够催化OPS和L-谷氨酸生成N-(1-amino-1-carboxy-2-ethyl)-glutamic acid (ACEGA) （Chem. Biol. 2014, 21, 379-388）;鉴于toxin A与ACEGA结构的相似性，研究人员猜测AMA可能也是由SbnA同源蛋白催化生成；之后通过同源蛋白比对、转录水平分析、基因簇分析以及体外生化实验等方法，研究人员发现了一个PLP依赖的酶——AMA合成酶——能够连续催化两步反应生成AMA。体内敲除实验证明AMA合成酶是米曲霉体内唯一催化AMA生物合成的酶；并通过在大肠杆菌体内重构AMA的合成途径进一步阐释了该酶的生物活性。
图2. AMA合成酶以OAS/OPS和L-Asp为底物，连续催化两步反应生成toxin A和AMA
已经被报道的SbnA的同源蛋白对于OAS和OPS有明显的偏好性（如SbnA只能以OPS为底物），而研究人员发现AMA合成酶可以同时接纳OAS和OPS为底物。研究人员通过酶学常数测定和紫外-可见光谱实验证明OPS是AMA合成酶的最适底物，并通过多重序列比对找到了可能与OAS识别相关的氨基酸。此外，与其他SbnA同源蛋白不同的是，除了PLP依赖的结构域，AMA还包含一个Rhodanese结构域 （RHOD）。研究人员发现，将RHOD去除后就几乎检测不到催化活性；全长的AMA合成酶在溶液中以多聚体存在，而RHOD去除后的蛋白以均一的单体存在，根据以上实验结果，作者推测RHOD可能是通过影响AMA合成酶的聚合状态来影响酶活。
图3. 以toxin A为底物，测定AMA合成酶对OPS和OAS的酶学常数
之后研究人员通过同源建模及分子对接阐明了AMA合成酶的立体选择性以及催化两步反应的原因；并通过构建底物结合口袋的突变体找到了维持催化活性必须的氨基酸；之后研究人员探索了AMA合成酶的底物谱，发现通过其能够接受识别并接受除了赖氨酸和精氨酸以外的所有天然氨基酸，并且也能够接受D构型的氨基酸为底物；进一步地，通过对AMA合成酶的突变体进行底物筛选，作者发现突变体R234A能够识别甲胺、乙醇胺等没有α-COOH的脂肪胺类化合物以及苯甲胺、苯胺等芳香族化合物；研究人员通过酶学方法分离制备了一系列结构新颖的化合物。
图4. AMA合成酶的同源建模以及底物的分子对接
表1. 本研究从酶学反应体系中制备得到了化合物2a-2i, 并测定了以苯胺，苯甲胺，环己胺为底物时，所示产物对应OPS的转化率
综上所述，本项研究首次解析了AMA在米曲霉中的完整生物合成途径以及AMA合成酶的催化机制，发现AMA合成酶的底物谱较广，通过一锅法的酶学反应制备了一系列结构新颖的toxin A以及AMA的类似物，并通过对该酶的改造进一步扩大了其底物识别范围。比起之前已经报道的所有AMA化学合成或化学酶法合成路线，该生物合成只需要一个酶催化两步连续反应实现分子构建，这种非常高效的“一箭双雕“的合成策略凸显出其巨大的优势。该研究为AMA的大量制备以及发现新的β-内酰胺类抗生素的佐剂奠定了基础，也进一步拓展了新型碳-氮键（C-N bond）合成酶在生物催化中的应用前景。
在本研究工作中，北京大学雷晓光课题组博士生郭倩倩、吴东山以及博士后高磊为共同第一作者，王初课题组刘源博士为该工作的计算模拟做出了重要贡献，雷晓光教授为本文的通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金、国家重点研究发展计划、北京市“卓越青年科学家计划”，北京分子科学国家研究中心，以及北大-清华生命科学联合中心的资助。高磊博士也得到了生命科学联合中心优秀博士后基金的资助。
原文链接：http://dx.doi.org/10.1021/acscatal.0c01187.
