2021年6月10日，北京大学生命科学学院、生命科学联合中心孔道春实验室在美国科学院期刊PNAS 在线发表了题为“The intra-S phase checkpoint directly regulates replication elongation to preserve the integrity of stalled replisomes”的研究论文（https://www.pnas.org/content/pnas/118/24/e2019183118.full.pdf）。该研究回答了过去50年在checkpoint（细胞周期检验点）调控维持真核细胞DNA复制叉稳定领域的两个核心问题：1）停顿的DNA复制叉为什么会不稳定，并倾向于垮塌；2）checkpoint调控维持停顿复制叉稳定的核心分子机制是什么？
正常细胞生长过程中，基因组不稳定主要是来自于DNA复制错误，大约2/3癌症的发生被认为是由于DNA复制错误导致的（Tomasetti & Vogelstein (2015), Science, 347: 78-81; Tomasetti et al. (2017), Science, 355: 1330-1334），而DNA复制错误主要是来自于DNA复制叉的不稳定。DNA复制叉主要由两部分构成（图1）：Y字型的DNA结构和DNA复制体 (Replisome)。DNA复制体包含一系列与复制相关的蛋白质及蛋白质复合物，其中，最重要的是打开双链DNA模板的CMG（Cdc45-MCM-GINS）解旋酶复合物，以及进行新生链DNA合成的DNA聚合酶--DNA Pol α、δ、ε 。正常移动的DNA复制叉是相对稳定的，DNA复制体中的CMG解旋酶与DNA聚合酶在物理及生化功能上紧密偶联。但当DNA复制叉遭遇复制障碍停顿下来时，停顿的DNA复制叉被证明是不稳定的，倾向于垮塌。
上个世纪60年代末，在裂殖酵母里筛选到了一株突变株，命名为rad3-136。很快发现rad3-136突变株对羟基脲（Hydroxyurea (HU), 抑制dNTPs合成，导致DNA复制叉停顿）高度敏感。至此，细胞维持停顿DNA复制叉稳定的机制研究拉开了序幕。Rad3及相关蛋白介导的细胞调控，于1988年被命名为checkpoint调控（Weinert & Hartwell (1988), Science, 241: 317-322）, Rad3被归类为ATR激酶。过去50年，前后上千个实验室，用两代人的时间，发表了上万篇研究文章，证明checkpoint是维持停顿DNA复制叉稳定的必需细胞调控。在checkpoint缺失或缺陷的细胞，停顿的DNA复制叉发生垮塌，导致DNA复制不能完成，及基因组的极度不稳定。但是，在试图阐明checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的机制研究方面，碰到了极大阻力，阻力主要是来自于checkpoint调控的靶蛋白极难被确定，已发表文章的结论也互相矛盾，导致checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的核心机制长期得不到确定。
图1真核细胞DNA复制叉及S期细胞周期检验点（Leman AR, Noguchi E. The replication fork: understanding the eukaryotic replication machinery and the challenges to genome duplication. Genes. 2013 Mar;4(1):1-32.）。酵母Chk2在高等真核生物的功能同源蛋白是Chk1。
通过大规模的遗传筛选，孔道春实验室发现，复制解旋酶CMG（Cdc45-MCM-GINS）复合体的一个亚基Cdc45的突变能极大降低（600-3000倍）checkpoint 通路缺陷的细胞对 HU的敏感性，暗示Cdc45或CMG复合体可能被checkpoint调控。然后，通过一系列遗传及生化分析，证明Rad3ATR-Cds1Chk2 checkpoint通路直接调控DNA复制解旋酶 CMG复合体。孔道春实验室发现：当DNA复制叉停顿后，Cds1Chk2同时磷酸化Cdc45亚基上的三个丝氨酸残基（且这三个Chk2/Chk1磷酸化位点在不同物种中相对保守）。这三个丝氨酸残基的磷酸化导致CMG复制解旋酶活性深度降低。CMG复制解旋酶活性的降低使得它不能脱离停顿复制叉，不能与被阻挡的DNA聚合酶分开。这样，停顿的DNA复制体（Replisome）及复制叉的生化完整性得到了维持，从而阻止了停顿DNA复制叉的垮塌。
为什么停顿复制叉里的复制解旋酶与DNA聚合酶会倾向于分开呢？这关联到两件事情：一是DNA复制体或DNA复制叉的基本生化特性；二是正常细胞生长过程中导致复制叉停顿的基本原因。DNA复制体中，DNA Pol ε负责合成前导链 （leading strand）合成, DNA Pol α和δ负责后随链（lagging strand）合成。由于后随链的合成稍微滞后于CMG解旋酶介导的DNA链解开，导致后随链的DNA模板上恒定的出现一段约200核苷酸长度的单链DNA区域。如果该单链DNA区域有形成DNA二级结构的序列，如G4、三股链、发夹结构等，DNA二级结构的形成就是一个大概率事件。形成的DNA二级结构会阻挡 DNA Pol α、δ的移动，导致复制叉停顿。在酵母细胞的染色体DNA上，大约有2000-4000个能形成DNA二级结构的序列。在人细胞中，能形成DNA二级结构的数目大约有数百万个（~75万个G4结构，及数倍于G4的三股链结构等）。因此，DNA二级结构导致的复制叉停顿是一个经常发生的生物事件。在前导链或后随链的DNA模板上, 如果有碱基损伤（每个人细胞每天有约105级别的这类损伤）或化学修饰，也会阻挡DNA Pol α、δ、ε（DNA聚合酶的活性中心非常精巧，只能容纳AT或GC配对，但不能容纳AC或GT配对，以保证DNA复制的精准性），导致复制叉停顿。当DNA聚合酶被阻挡后，CMG解旋酶还要往前移动，这样就会导致CMG解旋酶与DNA聚合酶物理上的分开，导致复制叉垮塌。
经过上千个实验室50年的不懈努力，checkpoint调控维持停顿DNA复制叉稳定的核心机制最终得到了阐明。即，1）停顿复制叉不稳定、倾向于垮塌的根本原因是：当DNA聚合酶被阻挡后，复制解旋酶与DNA聚合酶倾向于分开；2）checkpoint调控维持停顿复制叉稳定的核心机制是：降低复制解旋酶的活性，阻止复制解旋酶脱离复制叉 或DNA聚合酶，维持两者之间在物理及生化功能上的紧密偶联，从而维持停顿复制叉稳定，并保持它的生物学功能（图2）。孔道春实验室于2019年发现的chromsfork调控，通过提高停顿复制叉周围的染色质结构紧密程度，也是为了阻挡复制解旋酶脱离复制叉，以维持复制叉稳定 (Feng et al. (2019), PNAS, 116(29):14563-14572)。
图2. Cds1Chk2磷酸化复制解旋酶CMG里的Cdc45亚基，深度降低复制解旋酶活性，阻止复制解旋酶与DNA聚合酶分开，从而稳定停顿复制叉。
孔道春教授为该论文的通讯作者。刘阳博士和王露（2015级博士研究生）为该论文的共同第一作者。许鑫、袁越、张波、李泽阳、谢雨晨、闫睿、郑泽琦、北京大学生命科学学院纪建国教授、英国Sussex大学的Johanne M. Murray和Antony M. Carr教授也对本研究作出重要贡献。感谢实验室所有成员的帮助。本工作得到了生命科学联合中心、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金委、蛋白质与植物基因研究国家重点实验室、以及生命科学学院仪器中心（成像平台及流式平台）的大力支持，在此，表示衷心感谢。
